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自然子刊,ctDNA,液体活检中

发布来源:互联网    发布时间:2021-04-13 23:18

二代基因测序(Next Generation Sequencing, NGS)技术的诞生使得肿瘤患者一次检测所有靶向用药的机会成为可能,而液体活检技术的发展则拓宽了肿瘤NGS应用的场景和人群范围,将可以从精准医疗中获益的患者从晚期逐步推进到早期,同时可以帮助医生进行患者治疗的全程。但液体活检质量的评估标准对医生和患者来说,仿佛一直是一种看不见、摸不着的东西。

市场上数以百计的肿瘤NGS检测公司都在宣称可以精准的ctDNA液体活检,临床如何分辨产品的好坏?听起来高大上的灵敏度和特异性分别是什么意思,它们很难并存吗?好的产品可以做到什么样的准确性?

各位别急, Nature Biotechnology 刚刚发布的重磅研究项目终于给了我们一个初步答案! 项目首次通过单盲的评估实验,了一个直观、客观、全面、且定量地了解液体活检的机会,从而给出标准和依据帮助医生判断什么是高质量的液体活检产品,以及目前液体活检的技术边界在哪里。

自然子刊,ctDNA,液体活检中(图1)

论文首页截图

说到高难度,其实真不是FDA想要为难谁!为保证在范围内的正确应用,FDA MAQC协会于2005年便开启了微阵列基因芯片(Microarray)相关的质控项目。2018年开始的第四阶段(MAQC4)正是为了适用于NGS的标准分析协议和质控标准,以增强科学研究和精准医学,MAQC4也被称为Sequencing Quality Control Phase 2,即SEQC2。SEQC2包含了针对一系列NGS技术的分析性能评估验证子项目,本次nature子刊发布的是循环肿瘤DNA(ctDNA)靶向测序研究相关结果。

简单来说,FDA想要制定NGS检测的行业标准和技术指南,ctDNA靶向测序方面找了5家全球领先肿瘤靶向NGS检剂盒厂商,出了一个大难题,看看各个厂家在临床关键指标的性能表现如何。

这5家分别是,大名鼎鼎的 Roche Sequencing Solutions、Illumina、Integrated DNA technologies、Thermo Fisher Scientific,还有中国的Burning Rock燃石医学, 燃石朗清

具体来说,经过一系列复杂操作(此处省略几百字)制成的不同等位基因变异频率(variant allele frequencies,VAF)浓度梯度的实验样本被发放给各家试剂盒生产商,并由生产商在美国、英国、中国和澳大利亚等地的13个实验室进行单盲检测,每个实验室使用5个液体活检panel中的一个或者多个测序分析。分析结果最终递交至FDA进行汇总。 由FDA根据提交的结果评估panel检测灵敏度、特异性、准确性、可重复性和稳定性等临床实践核心指标

自然子刊,ctDNA,液体活检中(图2)

实验流程设计逻辑示意图

SEQC2考题已经揭晓了“答案”这些答案为临床辨别优秀的液体活检检测产品了方法指导,主要包括以下几个方面:

液体活检中,只要测序深度足够深,就能测得足够准吗?

在SEQC2项目呈现的数据中,两个参数揭示了不同建库技术之间的能力差别,一是“ 有效片段回收率”它体现了在同样一管血中,经过重重的信号采集和处理后,有多少有效的细胞游离DNA(cell free DNA,cfDNA)片段被保留下来用于分析,这一能力直接决定ctDNA检出的可能性。

自然子刊,ctDNA,液体活检中(图3)

25ng投入量下有效片段回收率

二是“ panel覆盖均一性”在同样都是25ng的DNA投入量的情况下(相当于7500个基因组拷贝)SEQC2比较了不同panel测序深度对目标设计区域覆盖率的差异,更好的覆盖均一性可以保障即使困难区域也能得到良好的覆盖,从而提升检测的灵敏度。

自然子刊,ctDNA,液体活检中(图4)

液体活检panel覆盖均一性评估

而在这两个参数上,燃石朗清 ?都展现了最好的表现,这也解释了为什么在原始测序深度并不突出的情况下,燃石朗清 ?却做到了最高之一的灵敏度。

灵敏度和假阳性率难两全,产品可以经受灵敏度和假阳性率双重考验吗?

高灵敏度的液体活检是对低频突变不漏检的保障,同时低假阳性率则帮助患者抓住真正获益的治疗机会,避免了治疗费用和宝贵的治疗时间窗口的浪费,技术上的相互“制衡”似乎造成了灵敏度和假阳性率难两全的局面。兼顾灵敏度和假阳性率也成为了检测机构保障液体活检结果准确性必须要攻克的难题

SEQC2通过对每个文库目标区域已知变异的检出结果分析,来评估基于杂交捕获法的ctDNA检测灵敏度。 在高频突变中,所有panel都表现出了极高的灵敏度,再次佐证了样本中ctDNA含量对检测结果的重要影响。但在VAF到达0.5%以下的“区”时,不同panel的表现开始呈现显著的差异。其中,低VAF突变中燃石朗清 ?和xGen Non-small Cell Lung Cancer成为灵敏度最佳的NGS液体活检panel之一:在VAF为0.3-0.5%时,灵敏度>90%。

自然子刊,ctDNA,液体活检中(图5)

不同VAF对ctDNA检测灵敏度的性能评估

而在保证高灵敏度的同时,如何保持低假阳性率,来确保结果的准确性?参与SEQC2的所有panel分析均使用独特的分子标识符(Unique Molecular Identifiers,UMIs)来纠正测序错误,假阳性率相对较低。考虑panel大小后,在25 ng DNA投入量下,燃石医学panel的假阳性率最低(0.03 FP/kb)错误的变异几乎完全发生在VAF<0.5%的区域。 综合灵敏度与特异性的整体评估,NGS液体活检panel中燃石朗清

自然子刊,ctDNA,液体活检中(图6)

25ng DNA投入量时,不同panel 假阳性率表现

自然子刊,ctDNA,液体活检中(图7)

25ng DNA投入量时,燃石朗清?的准确性最佳

中心实验室的检测能力是否可以在院端复现?

SEQC2评估了同样的样本在实验室内和实验室间的检测结果可重复性,数据显示, 同一panel在同一实验室内不同批次之间和不同实验室不同批次之间的可重复性是相似的。这意味着这些参与SEQC2研究的NGS panel试剂盒的检测性能和生信分析具有较强的稳定性,结果的波动性来自随机而非性的室间差异

自然子刊,ctDNA,液体活检中(图8)

实验结果可重复性评估

同时, 所有panel都在中高频变异(VAF 0.5-2.5%、VAF>2.5%)中呈现了较高的可重复性,但在低频变异(VAF 0.1-0.5%)的可重复性有所下降,这也提示了临床实践中ctDNA 低频变异为液体活检带来的。综合所有实验室内和实验室间的差异性评估,燃石朗清 ?的分析性能可重复性同样表现优异。

难上加难:当cfDNA总量极低的时候,液体活检表现如何?

SEQC2试题的最后,测量了高(50 ng)中(25 ng)和低(10 ng)DNA投入量时每个杂交捕获panel分析的性能。 在最低10 ng DNA投入量时,燃石朗清

自然子刊,ctDNA,液体活检中(图9)

不同DNA投入量时对panel性能的综合考量

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本文相关词条概念解析:

活检

活体组织检查(biopsy)简称“活检”,亦称外科病理学检查,简称“外检”;是指应诊断、治疗的需要,从患者体内切取、钳取或穿刺等取出病变组织,进行病理学检查的技术。这是诊断病理学中最重要的部分,对绝大多数送检病例都能做出明确的组织病理学诊断,被作为临床的最后诊断。

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